炭疽芽孢桿菌A16R株       

       為研究炭疽芽孢桿菌A16R株中的同源整合頻率和機制，采用不能在鏈霉菌中復制的大腸桿菌質粒轉化鏈霉菌Streptomyces lincolnensis B48。質粒pYYE04al上攜帶的被硫鏈絲菌素抗性基因滅活的林可霉素生物合成基因與染色體DNA上的同源基因發生重組，經過低抗篩選，得到兩個突變子S.lincolnensis YY1和S.lincolnensis YY2。進一步以硫鏈絲菌素抗性基因為探針雜交染色體DNA smaⅠ片段，S.lincolnensis YY1和S.lincolnensis YY2都得到1.5kb的陽性條帶；而以缺失的lacZ基因為探針雜交染色體DNA成HindⅢ和SmaⅠ聯合酶切片段，只有S.lincolnensis YY2得到4.4kb的陽性條帶。Suthern雜交結果表明S.lincolnensis YY1是由同源交換或二次重組產生的，而S.lincolnensis YY2為同源整合的結果。為驗證同源整合子上大腸桿菌復制子和氨芐抗性基因的存在，用Sph Ⅰ酶切染色體DNA后連接，連接液轉化E.coli JM83感受態細胞，在氨芐抗性板上得到2個轉化子，命名為pSLE1。對其進行酶切鑒定的結果表明它是轉化質粒pYYE04al的一部分。

       構建炭疽芽孢桿菌A16R株eag基因缺失突變株，為研究eag基因的功能奠定了基礎。[方法]本研究以我國人用炭疽桿菌活疫苗A16R株中eag基因為目的缺失基因，根據炭疽芽孢桿菌Ames株基因組序列，利用軟件設計了擴增上下游同源臂以及抗性基因引物，構建了重組質粒，將該重組質粒電擊轉入炭疽桿菌A16R感受態細胞中，利用同源重組原理篩選到炭疽桿菌A16R株eag基因缺失突變株。在分子水平及蛋白質組學方面對基因缺失突變株進行驗證。[結果]成功構建了重組質粒，經同源重組后獲得eag基因缺失突變株。PCR鑒定表明目的基因已經丟失；SDS PAGE表明野生株與突變株在93 kDa處有差異蛋白條帶，經質譜鑒定分析該條帶為目的基因所表達的EA1蛋白；雙向電泳結果顯示突變株與野生株比較明顯缺失3個蛋白點，經質譜分析后確定這3個點都是EA1蛋白。[結論]成功獲得eag基因缺失突變株，為深入研究eag基因的功能奠定了基礎，同時也為炭疽芽孢桿菌重要基因功能的研究建立了一個良好的技術平臺。