鑒定細胞死活的方法有哪些

活細胞的鑒定在生物學和醫學上具有很重要的意義。細胞培養過程中要隨時記錄細胞的生長情況，需要經常測定細胞的存活率；在腫瘤細胞的研究中，為了檢驗各種藥物對腫瘤細胞的殺傷力，也需要測定腫瘤細胞的存活率。在臨床醫學中死活細胞的鑒定也有很大的應用，例如為了檢測某一男子的生育能力，測定精子細胞的存活力是比較常用的辦法。

死活細胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。但是通過直接的形態觀察來鑒別細胞死活，實驗結果很容易受操作者的主觀因素的影響，存在一定的誤差，所以，在實際操作中也常采用一些儀器來進行的批量檢測。

不同的死活細胞鑒定方法有各自不同具體的反應機理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細胞在生理機能和性質上的差異。

常用的方法包括染色法和儀器分析法。

1 染色法

染色法分化學染色法和熒光染色法，根據染色機理的不同，染料或使死細胞著色，或使活細胞著色。死活細胞在生理機能和性質上的差異主要包括：

死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質選擇性的通過；而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質。臺盼藍，又稱錐藍，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細胞膜。所以經臺盼藍染色后只能使死細胞著色，而活細胞不被著色。甲基藍有類似的染色機理。植物細胞的質壁分離也可鑒定死活。

死活細胞在代謝上的差異：是采用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據。美藍是一種無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化性變為無色的還原型，因此美藍染色后活的酵母細胞無色；而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍處于氧化態，從而被染成藍色或淡藍色。

熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養動植物細胞以及植物細胞原生質體的生活力鑒定染料，其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：FDA本身不產生熒光，也無極性，能自由滲透出入完整的細胞膜。當FDA進入活細胞后，被細胞內的脂酶分解，生成有極性的、能產生熒光的物質——熒光素，該物質不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞膜內，因而使有活力的細胞產生綠色熒光；而無活力的細胞因不能使FDA分解，而無法產生熒光。

除此之外，還有一些細胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著紅色，而細胞質和細胞核不被著色；死細胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細胞中，細胞核和細胞質被染成紅色。有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結合使用，如甲基藍-中性紅混合染色法。

2 儀器分析法

可采用微電極技術（利用死活細胞膜兩側電位的差異）、全自動分析細胞記數儀和流式細胞儀等，可對細胞的死活進行的批量檢測。

德國INNOVATIS出產的全自動Cedex細胞存活率/細胞計數儀/細胞分析儀是 世界上*臺高分辨率、高清晰度掃描（）細胞分析儀，具有全自動臺盼藍染色、顯微CCD成象、CEDEX工作站軟件，可用于制藥、醫學、發酵、免疫、 病理、毒性測試、生物技術等學科的研究開發和工業生產過程中的細胞計數和分析。自動分析結果，檢測分析數據輸出（11項）：總細胞數目，總細胞濃度 （cells/mL） ；活細胞數目，活細胞濃度 （cells/mL）；死細胞數目，死細胞濃度 （cells/mL） ；細胞存活率 （%） ；細胞的平均圓度 （compactness） ；細胞的平均直徑 （um） ；細胞團比例 （Aggregate Rate）；細胞直徑分布圖 （Diameter Histogram）；細胞團分布圖 （Aggregate Histogram）；細胞圓度分布圖 （Compactness Histogram） ；細胞生長時間曲線（C*tion Time Chart）。

流式細胞儀法 用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內而發出熒光的物質，例如FDA可被活細胞持留而發出黃綠色熒光，若細胞有損傷 則會從細胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細胞膜，但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進行染色，例如碘化丙啶（ PI,Propidium iodide ）和溴化乙錠（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針。碘化丙啶（PI）不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪 失，碘化丙啶（PI）可以染色壞死細胞。目前常用的一種細胞凋亡與壞死檢測試劑盒則含有Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）兩種熒光染料。細胞發生凋亡時，染色質會固縮，Hoechst 33342可以穿透細胞膜，染色后凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強。上述兩種染料雙染后，使用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測時，正常細胞為弱紅色熒光＋弱 藍色熒光，凋亡細胞為弱紅色熒光＋強藍色熒光，壞死細胞為強紅色熒光＋強藍色熒光。